1概述

熒光定量PCR是近年發展起來的一種新(xīn)的實時定量檢測特定核酸技(jì )術，它是核酸探針技(jì )術、熒光共振能(néng)量傳遞技(jì )術和PCR技(jì )術的有(yǒu)機結合，而探針是整個熒光定量PCR反應的核心。其主要功能(néng)是對未知模闆進行定量分(fēn)析，确定病毒含量。實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規的PCR相比，具(jù)有(yǒu)靈敏性高、特異性強、能(néng)實現多(duō)重反應、自動化程度高、無污染、實時和準确等特點。目前已在基因工(gōng)程，分(fēn)子生物(wù)學(xué)研究，畜牧獸醫(yī)等領域得以廣泛應用(yòng)

2熒光定量PCR技(jì )術的原理(lǐ)

熒光定量PCR在PCR反應體(tǐ)系中(zhōng)加入熒光染料或熒光基團，這些熒光物(wù)質(zhì)有(yǒu)其特定的波長(cháng)，利用(yòng)熒光定量PCR儀自動監測整個PCR擴增過程中(zhōng)熒光信号的積累，最後通過标準曲線(xiàn)對未知模闆進行定量分(fēn)析的方法。由于PCR并非一直呈指數擴增，使得PCR擴增産(chǎn)物(wù)的數量與原始模闆數量之間沒有(yǒu)一個固定的比例關系，通過檢測擴增産(chǎn)物(wù)很(hěn)難對原始模闆進行準确定量，因此熒光定量PCR引入一個概念，即循環阈值(cycle threshold value，Ct)。其含義是在PCR循環過程中(zhōng)，熒光信号開始由本底進入指數增長(cháng)階段的拐點所對應的循環次數。經數學(xué)理(lǐ)論證明，Ct值與起始模闆數的對數值成反比線(xiàn)性關系，起始拷貝數越多(duō)，Ct值越小(xiǎo)。通常用(yòng)不同濃度的标準樣品的Ct值來産(chǎn)生标準曲線(xiàn)，然後計算相對方程式，使用(yòng)這個方程式計算出未知樣本的初始模闆量。

2.1熒光定量PCR技(jì )術的兩種定量形式

熒光定量PCR标準品選擇很(hěn)重要，盡量選擇與實際檢測樣品結構近似的樣品，通常采用(yòng)重組質(zhì)粒或PCR擴增産(chǎn)物(wù)作(zuò)為(wèi)标準品來實現絕對定量。一般情況下，以重組質(zhì)粒為(wèi)标準品較常見，通常将PCR産(chǎn)物(wù)克隆到載體(tǐ)上，然後抽提出質(zhì)粒，經分(fēn)光光度計測量濃度，計算出拷貝數，并進行梯度稀釋。絕對定量也具(jù)有(yǒu)相應的不足，标準品的穩定性很(hěn)難得到保證，标準品長(cháng)時間保存可(kě)能(néng)會降解，緻使濃度下降，單位體(tǐ)積的拷貝數不準确，影響定量PCR的結果，導緻絕對定量失去意義。

相對定量是指在測定目的基因的同時測定某一内源性管家基因，該管家基因主要是用(yòng)于核苷酸的拷貝數的比較、反映反應體(tǐ)系内是否存在PCR擴增的影響因素，通常選用(yòng)的管家基因有(yǒu)GAPDH、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA。相對定量包括三種方法：（1）雙标準曲線(xiàn)法，目的基因、管家基因分(fēn)别作(zuò)标準曲線(xiàn)，然後從各自的标準曲線(xiàn)上求出初始模闆量，經管家基因均一化處理(lǐ)後，求出目的基因的相對含量。（2）2-△△Ct法，當目的基因和管家基因的擴增效率相等，這時就不需要作(zuò)标準曲線(xiàn)，而是通過比較△Ct值來确定目的基因的表達量。（3）動力學(xué)法，在PCR反應中(zhōng)，即使相同的基因，擴增效率也不可(kě)能(néng)為(wèi)1，此方法就很(hěn)好地反映了每次循環的擴增效率，更接近于實際反應，但由于動力學(xué)法涉及到許多(duō)數學(xué)公(gōng)式，計算較複雜，未能(néng)得到廣泛的運用(yòng)。

在應用(yòng)熒光定量PCR技(jì )術中(zhōng)，無論是絕對定量還是相對定量仍存在問題有(yǒu)侍解決。在标準曲線(xiàn)定量中(zhōng)，标準品的制備是一個必不可(kě)少的過程。目前沒有(yǒu)統一标準，各個實驗室所用(yòng)的繪制标準曲線(xiàn)的樣品各不相同，緻使實驗結果缺乏可(kě)比性。另外，由于定量PCR在儀器中(zhōng)自動生成結果，沒有(yǒu)電(diàn)泳檢測的過程，因此無法判斷擴增片段的大小(xiǎo)。此外，熒光定量PCR技(jì )術實驗成本比較高，從而也限制了其廣泛的應用(yòng)。

2.2 熒光定量PCR技(jì )術的種類

實時熒光定量PCR技(jì )術的常用(yòng)的方法包括熒光染料法和探針法。

非特異性DNA結合染料法是在常規PCR反應體(tǐ)系中(zhōng)加入了染料分(fēn)子，反應進行時染料與DNA雙鏈結合，結合後在激發光源的照射下發出熒光信号，沒結合不會被激發出任何熒光信号，其信号強度代表雙鏈DNA分(fēn)子的數量。随着PCR産(chǎn)物(wù)的增加，結合量也增加，同時熒光信号也在增大。染料分(fēn)子除了與特異性的靶序列擴增産(chǎn)物(wù)結合外，還能(néng)與在PCR擴增過程中(zhōng)形成的引物(wù)二聚體(tǐ)、非特異性擴增産(chǎn)物(wù)結合，從而造成擴增效率的降低、特異性差。所以該方法對引物(wù)設計和試驗環境要去很(hěn)高。為(wèi)了分(fēn)辨非特異性結合，運用(yòng)溶解曲線(xiàn)的分(fēn)析數據是很(hěn)好的方法。目前應用(yòng)最廣泛的染料是SYBR Green I。

探針法主要是利用(yòng)了具(jù)有(yǒu)5′~3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶，并加入了具(jù)有(yǒu)序列特異性的熒光探針。該方法主要特點是模闆不但與引物(wù)結合，還要與序列特異性的熒光探針結合，從而提高了檢測的特異性。與染料法相比不用(yòng)繪制溶解曲線(xiàn)，特性性強，試驗結果更為(wèi)可(kě)靠。目前市場上的探針主要種類有(yǒu)：TaqMan、Molecular Beacon、hybridization probe等，其中(zhōng)以TaqMan探針應用(yòng)最廣泛，但探針标記成本較高，不便普及應用(yòng)

3熒光定量PCR技(jì )術在動物(wù)醫(yī)學(xué)領域中(zhōng)的應用(yòng)

随着熒光定量PCR技(jì )術的成熟和發展，對許多(duō)難培養或不能(néng)培養的動物(wù)傳染病病原用(yòng)熒光定量PCR技(jì )術進行診斷就簡單易行。該技(jì )術還進一步的彌補了一般技(jì )術對疾病亞臨床或潛伏感染的診斷無能(néng)為(wèi)力的缺點，并且解決了許多(duō)烈性傳染病對人和動物(wù)造成危害的問題，使疾病病原檢測變的更加安(ān)全。目前國(guó)内外已建立了許多(duō)用(yòng)于病原體(tǐ)檢測的熒光定量PCR方法。Takele等建立了定量檢測來源于豬的PERV的TaqMan技(jì )術。熒光定量PCR技(jì )術對于結核分(fēn)枝杆菌的檢測在國(guó)内應用(yòng)的比較廣泛，許多(duō)家公(gōng)司已研發出用(yòng)于定量檢測的試劑盒，并推向了市場。Bumstead等（1997）用(yòng)熒光定量PCR檢測到雞馬立克氏病病毒存在，而且可(kě)準确定量。陳玉棟等（2003）首次建立了用(yòng)于檢測豬瘟兔化弱毒苗的熒光定量PCR方法，解決了豬瘟疫苗株和野毒株很(hěn)難區(qū)分(fēn)的難題。宋志(zhì)軍等（2006）建立了豬PRRSV TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，具(jù)有(yǒu)很(hěn)高的敏敏性，并在2009年王秋泉根據目前流行的高緻病性PRRSV Nsp2基因片段的特征變化設計了一對引物(wù)和探針，建立了檢測PRRSV變異株的熒光定量PCR方法。另外，熒光定量PCR技(jì )術還應用(yòng)其他(tā)重要動物(wù)傳染病的診斷，例如，雞新(xīn)城疫、禽流感、鴨乙型肝炎、僞狂犬病和口蹄疫等。總之，該技(jì )術為(wèi)獸醫(yī)領域的病原診斷研究提供了重要的方法。

此外，熒光定量PCR技(jì )術在其他(tā)方面也得到了廣泛的應用(yòng)，如寄生蟲的檢測和鑒别、細胞因子表達定量檢測、環境監測、動物(wù)檢疫和轉基因的研究等。随着分(fēn)子生物(wù)學(xué)的發展，以及試驗人員在實踐中(zhōng)經驗的積累，會使熒光定量PCR技(jì )術得到進一步完善。http://www.swzp.com/zdcp2.html